Un nuevo kit RT - PCR multiplex en tiempo real para Coronavirus

Nuevo coronavirus (2019 ncov) RT - PCR multiplex en tiempo real (detección de 3 genes)

Instrucciones de uso

1. Uso previsto

RT - PCR multiplex en tiempo real para la detección in vitro de ARN del nuevo coronavirus 2019

Las muestras de hisopo nasofaríngeo, hisopo orofaríngeo y esputo fueron detectadas por PCR en tiempo real. Se considera un método auxiliar para diagnosticar la infección por el ncov en 2019.

2. Principio de RT - PCR en tiempo real

El principio de detección en tiempo real se basa en el análisis de la nucleasa fluorescente de 5 '. En el proceso de reacción PCR, la polimerasa de ADN corta la sonda en el extremo 5 'y separa el tinte reportero

Sólo cuando la sonda se cruza con el ADN objetivo, se puede separar del tinte apagado. El Corte resulta en la generación de una señal fluorescente por el tinte de informe que se corta.

Sistema de detección PCR. El período PCR (CT) en el que se detectó inicialmente un aumento de la señal fluorescente fue proporcional a la cantidad de productos PCR específicos. La monitorización en tiempo real de la intensidad de fluorescencia permite detectar productos acumulados sin reabrir el tubo de reacción después de la amplificación.

Cuando el material de partida era ARN, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (RT - PCR en tiempo real). En este método, el ARN se transcribe primero en ADN complementario

(CDNA) Transcriptasa inversa a través del ARN total. A continuación, el cDNA se utiliza como plantilla para la PCR en tiempo real.

3. Descripción del producto

Los coronavirus son una gran clase de virus, algunos pueden causar enfermedades humanas, otros pueden propagarse en animales como camellos, gatos y murciélagos. El ncov 2019 es un nuevo coronavirus. El kit contiene un sistema específico de uso inmediato para la detección del ARN del nuevo coronavirus (2019 ncov) por RT - PCR en tiempo real. La reacción fue analizada por RT - PCR en tiempo real en un solo tubo. Incluye la transcripción inversa (RT) para transcribir ARN viral en cDNA y la PCR en tiempo real para amplificar y detectar cDNA. La fluorescencia es emitida y medida por la unidad óptica del sistema en tiempo real durante la PCR. Detección de fragmentos amplificados de ADN viral

Se realiza en los canales del fluorometro FAM, Hex / Vic y cal fluor red 610 / Texas red.

4. Contenido del kit

Límite de detección (LOD): 200 copias / ML;

Nota: Lod depende del volumen de la muestra, el volumen de elución, el método de extracción de ácido nucleico, etc.

Factores. Si se utiliza el kit de extracción de ARN recomendado, Lod es el mismo que el declarado.

Sin embargo, si se utilizan otros métodos de extracción, debe realizarse una verificación adicional para garantizar el rendimiento analítico del análisis.

5. Almacenamiento

• Todos los reactivos deben almacenarse a una temperatura de - 20 ± 5 °C durante 6 meses.

• El análisis debe utilizarse en el plazo de un mes a partir de su apertura.

• Debe evitarse la descongelación y congelación repetidas (> 3x), ya que esto puede reducir la sensibilidad del análisis.

• enfriar todos los reactivos durante los pasos de trabajo.

• La super mezcla debe mantenerse fuera de la luz.

6. Materiales e instalaciones adicionales necesarios

• Gabinete biológico

• mezclador de vórtices

• congelador

• cabeza de filtro estéril para pipetas miniatura

• guantes desechables, sin polvo

• refrigeradores y congeladores

• Sistema PCR en tiempo real

• tubo / placa de reacción PCR en tiempo real

• pipeta (0,5 μl - 1000 μl)

• microtúbulos estériles

• contenedores de desechos de riesgo biológico

• soporte de tuberías

• microcentrifugadoras de mesa para tubos de tipo "eppendorf" (RCF hasta 16.000 X g)

Lea cuidadosamente estas instrucciones de uso antes de iniciar el procedimiento.

• El análisis debe ser realizado por personal cualificado.

• Las muestras clínicas deben considerarse materiales potencialmente infecciosos y prepararse en una máscara laminar.

• El análisis debe basarse en buenas prácticas de laboratorio.

• No utilice el kit después de la fecha de caducidad.

• evite el deshielo y la congelación repetidos del agente de prueba, ya que esto puede reducir la sensibilidad de la prueba.

• después de descongelar el reactivo, el tubo de ensayo se separa por vórtice y centrifugación antes de su uso.

• Preparación rápida de mezclas de reacción en hielo o en bloques de refrigeración.

• Establecer un espacio de trabajo separado: 1) configuración de la reacción, 2) Separación del ARN, 3)

Amplificación / detección de productos amplificados.

• Las pipetas, viales y otros materiales de trabajo no deben circular entre los dispositivos de trabajo.

• utilice siempre una cabeza de succión estéril con un filtro.

• use un abrigo y guantes separados en cada área.

• deseche las muestras y los desechos de laboratorio de conformidad con las normas locales de Seguridad.

• no use una pajita en la boca. No coma, beba ni fume en el laboratorio.

• Evitar aerosoles

8. Recogida, almacenamiento y transporte de muestras

• recoger muestras en tubos estériles;

• Las muestras pueden extraerse inmediatamente o almacenarse a una temperatura de 2°C a 8°c en un plazo de 24 horas o congelarse a una temperatura de - 70°C durante un período prolongado.

• Los especímenes clínicos deben transportarse de acuerdo con

Patógenos

9. Procedimientos

9.1 extracción de ARN

Se pueden suministrar kits de extracción de ARN de diferentes marcas. Puede utilizar su propio sistema de extracción o

Equipo comercial basado en la producción. Para la extracción de ARN, siga las instrucciones del fabricante

Instrucciones Los kits de extracción recomendados son los siguientes:

Cabe señalar que los controles negativos y los pares positivos del kit deben extraerse de la misma manera que las muestras.

9.2 control interno

El control interno (IC) del kit debe añadirse a la mezcla de extracción, a 1 μl por ensayo, para supervisar todo el proceso.

9.3 Protocolo RT - PCR

El volumen de la mezcla principal para cada reacción se trasladará de la siguiente manera:

Multiplicar el volumen de la supermezcla y la mezcla enzimática por reacción

Número de muestras, incluidas las muestras de referencia y las muestras preparadas. Razones:

Pipeta inexacta, siempre agregue muestras virtuales adicionales. Mezclar completamente y luego girar hacia abajo

Utilice una centrifugadora para un funcionamiento sencillo.

Pipeta de 20 μl de mezcla principal y filtro estéril a cada PCR en tiempo real

Placa / tubo de reacción. Se añadieron plantillas de 5 μl para extraer ácido nucleico de células negativas.

Grupo de control, Grupo de control positivo y muestra) a diferentes placas / tubos de reacción. Cierre inmediato

Placa / tubo para evitar la contaminación.

Gire rápidamente hacia abajo para recoger la mezcla principal y la plantilla en la parte inferior del tubo de reacción.

Ejecutar el siguiente protocolo en el instrumento Abi prism® 7500; Bio - Rad cfx96; Jerga:

Si utiliza el sistema Abi prism®, seleccione ninguno como referencia pasiva y apagado.

10. Umbral: justo por encima del nivel máximo de control negativo.

11. Control de calidad: el control negativo y el control positivo deben llevarse a cabo correctamente; De lo contrario

El resultado de la muestra no es válido.

12. Análisis e interpretación de datos

La siguiente tabla muestra los resultados esperados en tiempo real del nuevo coronavirus (2019 ncov)

RT - PCR multiplex Kit (detectó 3 genes). Si los resultados obtenidos no se ajustan a estas directrices,

Póngase en contacto con liferiver para obtener información.

Nota:

El laboratorio informará, según proceda, de sus resultados diagnósticos y cumplirá sus requisitos.

Sistema específico de presentación de informes.

No se ha determinado el mejor tipo de espécimen y el tiempo para el pico de los niveles virales durante la infección por ncovh en 2019. Puede ser necesario recoger varias muestras del mismo paciente para detectar el virus.

Si al menos dos genes orf1ab, N y e son positivos, la muestra es 2019 ncov

Positivo y optimista Si los tres genes son negativos, la muestra es 2019 ncov negativo; Si el resultado es

Orf1ab o gen n positivo, muestra 2019 positiva ncov; Si los resultados siguen siendo positivos sólo para egene, la muestra es positiva para 2019 ncov u otro coronavirus de origen cercano (puede ser reportada como positiva para 2019 ncov si se excluyen muestras de SARS y no humanos).

Para más preguntas, póngase en contacto con nuestro soporte técnico info@liferiverbiotech.com